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CHIP-SEQ助力脫髓鞘分子機制研究

發表期刊:《The Journal of Neuroscience》    IF:5.924

文章下載鏈接:
http://www.bljfr.tw/uploads/tmp/genedenovo-resume-1483431076.9103118.pdf

研究思路
總的來說,這篇文章的思路是這樣的:

研究背景和目的
脫髓鞘疾病,包括多發性硬化,是由髓鞘急性或慢性損傷、髓鞘再生不足引起的,目前其發病的具體分子機制還不清楚。髓鞘由少突膠質細胞組成,少突膠質細胞的損傷導致了脫髓鞘疾病,并且由于少突膠質細胞前體細胞(OPC)不能增殖成熟,導致髓鞘不能再生。目前的免疫療法對脫髓鞘的治療效果非常有限,因此需要其他更有效的治療手段來促進髓鞘再生。

Gpr17是一個7次跨膜G蛋白偶聯受體,之前的報道指出Gpr17信號通路的激活上調了分化抑制因子ID2的表達,在少突膠質細胞系中過表達Gpr17能損害髓鞘生成,而Gpr17敲除小鼠則過早表現出髓鞘形成。因此,本文通過ChIP-seq實驗、體外生化實驗和體內突變實驗,闡明Gpr17在溶血卵磷脂(LPC)誘導的脫髓鞘損傷中的作用機制,為臨床治療提供潛在的藥物靶點。


實驗材料
溶血卵磷脂(LPC)處理的大鼠少突膠質細胞,和未處理細胞。

研究結果
1、ChIP-seq鑒定細胞中的轉錄活躍基因
文章首先對LPC處理的少突膠質細胞和未處理對照細胞進行H3K27Ac的ChIP-seq測序,尋找全基因組范圍內轉錄活躍的區域和基因。


為什么要做H3K27Ac的ChIP-seq?
一般來說,轉錄活躍基因的轉錄起始位點都被H3K27Ac和H3K4me3修飾,而活躍的增強子可通過檢測H3K27Ac和H3K4me1的富集情況得到鑒定。因此本文利用H3K27Ac的ChIP-seq來在全基因組范圍內尋找轉錄活躍的區域和基因。
結果發現在差異組蛋白峰相關的基因中,有20多個轉錄因子,包括Olig2,Gmeb2,Psip1,Smad7,Klf6,和Nab1(圖1 E)。其中Olig2編碼了一個bHLH轉錄因子,之前已有報道該轉錄因子在少突膠質細胞的分化中有著重要作用。qRT-PCR證明,Olig2基因的表達量在LPC處理細胞中顯著上調(圖1 G)。


圖1 差異組蛋白峰相關基因(E);Olig2基因的qRT-PCR實驗結果(G)

然后進行Olig2的CHIP-seq實驗尋找Olig2的下游靶基因。通過分析差異peak相關基因,找到了Gpr17這個跨膜蛋白基因,并且發現Olig2峰和H3K27Ac峰在Gpr17基因的外顯子區overlap(圖2)。這些結果表明了Gpr17是Olig2的下游靶基因,可在LPC處理的少突膠質細胞中轉錄激活。


圖2 Olig2CHIP-seq實驗鑒定Gpr17

2、Gpr17的功能驗證
得到Gpr17這個候選基因后,就要從多個方面驗證Gpr17在脫髓鞘中的作用了。利用體外慢病毒shRNA轉染實驗沉默Gpr17的表達后,Gpr17拮抗劑pranlukast對細胞生存的保護作用被削弱了;另一方面,過表達Gpr17通過誘導細胞凋亡降低了少突膠質細胞的存活,并且Gpr17誘導的細胞凋亡是通過一個促凋亡基因Xaf1來實現的。這些結果表明了Gpr17能夠誘導少突膠質細胞的凋亡(圖3)。


圖3 Gpr17通過Xaf1調控少突膠質細胞的生存

3、Gpr17信號通路研究
進一步通過體內體外實驗來研究Gpr17調控Xaf1的分子機制,結果表明,LPC刺激激活了Gpr17基因的表達,引起細胞內cAMP濃度的下降,抑制了PKA信號通路的激活,從而抑制了c-Fos原癌基因的表達、促進了Xaf1促凋亡基因的表達,最后導致了少突膠質細胞的凋亡(圖4)。


圖4 Gpr17通過cAMP和PKA信號通路調控Xaf1的表達和少突膠質細胞的細胞凋亡

Gpr17除了能夠誘導少突膠質細胞的凋亡,還能夠抑制少突膠質細胞前體細胞(OPC)的分化與成熟,這是通過抑制Epac1基因的表達來實現的。這些結果也是通過嚴謹的體內體外實驗得到的(圖5)。


圖5 Gpr17通過抑制Epac1基因的表達來抑制少突膠質細胞的分化

4、體內功能驗證
最后,作者利用基因敲除小鼠研究Gpr17在脫髓鞘中的作用。發現敲除Gpr17能夠引起髓鞘再生;用Gpr17抑制劑pranlukast處理脫髓鞘小鼠,發現髓鞘再生(圖6)。以上這些結果表明了Gpr17可以作為一個潛在的臨床治療的藥物靶標。


圖6 抑制Gpr17促進了髓鞘再生

結  論
1、LPC處理少突膠質細胞激活了Gpr17基因的表達,引起細胞內cAMP濃度的下降,抑制了PKA信號通路的激活,從而抑制了c-Fos原癌基因的表達、促進了Xaf1促凋亡基因的表達,最后導致了少突膠質細胞的凋亡;
2、Gpr17通過抑制Epac1基因的表達,從而抑制了少突膠質細胞前體細胞的分化與成熟;
3、利用Gpr17拮抗劑pranlukast可以減緩少突膠質細胞的凋亡,促進髓鞘再生。


總  結
又是一篇論證嚴密的醫學類功能驗證文章,從候選基因篩選、基因功能驗證、作用機制研究、到最后的體內功能驗證,一步都不缺,并且每一步都是結合體內體外實驗多方面驗證,論據充分、論證嚴密,是這篇文章能夠發表5.9分的原因。

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